ホーム > プロトコル・使用説明書・MSDS > 組織中8-OHdG測定プロトコル Rev.111228
組織中8-OHdG/8-oxo-dG測定プロトコル
Detection of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in tissue/cultured cells.  
弊社8-OHdG測定キットを使用した組織中8-OHdG測定例をご紹介いたします。実施にあたっては実際にご使用になるサンプルに 合わせて実験条件をご検討ください。
1)組織からのDNA抽出
NaI法によりDNAを抽出してください。簡便なキットが市販されておりますのでご利用ください。
例)DNA Extractor WB kit (Sodium Iodide method) 和光純薬工業(株)code.291-50502
DNAエキストラクター TISキット 和光純薬工業(株)code. 296-67701など

加水分解処理に必要な酵素、バッファー等のセットが市販されております。
8-OHdG測定前処理試薬セット 和光純薬工業(株)code. 292-67801
2)DNA水溶液の濃度および純度検定
1)DNA水溶液の230nm、260nm、280nm、320nmにおける吸光度を分光光度計で測定し、 DNA水溶液の濃度、純度をチェックする。各波長の吸光度は320nmにおける吸光度をバックグラウンドとして差し引く。

2)DNA水溶液をDNA濃度が20~50μg/mLとなるようにTEにて希釈し、各波長における吸光度を測定する。

【DNA濃度計算法】
260nmの吸光度1.0がDNA 50μg/mLに相当するので、以下のようにしてDNA濃度を算出する。
DNA濃度 = 吸光度 X 50(μg/mL) X 希釈率
例)260nmにおける吸光度が0.55、320nmにおける吸光度が0.05の場合、DNA水溶液の濃度は
(0.55 - 0.05) * 50 * 50 = 1250 (μg/mL)

【DNAの純度の目安】
(260nmの吸光度) ÷ (280nmの吸光度) = 1.80~1.85
高純度品の場合には(260nmの吸光度) ÷ (230nmの吸光度) = 2.2~2.5
3)DNAの加水分解
1) DNA200μgを含むDNA水溶液に精製水を加えて135μLにする。
2) 200mM 酢酸ナトリウム(pH4.8) 15μL、1mg/mL nuclease P1を15μL(6unit)を加え、アルゴン置換後、 37℃で30分~1時間インキュベートする。
3) Tris-HCl (1M, pH7.4)を15μL、200units/ 0.7mL alkaline phosphataseを7μL添加して、アルゴン置換後、 37℃にて1時間インキュベートする。
4) 水解物を限外濾過フィルター(分画分子量10kDa)を用いて、14000rpm、10分間遠心して濾過する (除蛋白処理)。
5) 50μLのサンプル(計算上、53.5μgのDNAに相当)をELISAプレートの各ウェルに分注して 測定すると2~20ng/mLの範囲で測定可能。
  ※加水分解を行ったサンプルは、当日中に測定してください。
※ TE: 1mM EDTA / 10mM Tris-HCl, pH8.0
※ 限外濾過フィルター: 日本ポール(株)製 ナノセップ オメガメンブレン(Code. OD010C34)等が利用可能です。
※ 使用する水は全てChelex処理を実施してください(ChelexはBioRad Laboratoriesの登録商標です)。
【参考文献】
1) ML Hamilton, Z Guo, CD Fuller, H Van Remmen, WF Ward, SN Austad, DA Troyer, I Thompson, A Richardson:
A reliable assessment of 8-oxo-2-deoxyguanosine levels in nuclear and mitochondrial DNA using the sodium iodide method to isolate DNA.
Nucleic Acids Res. Vol.29(10), p2117-2126, 2001
(NaI法によるDNA抽出に関する文献です。Phenol抽出では酸化が起きる可能性があることを示唆しています。)
2) S Toyokuni, et. al.:
Quantitative Immunohistochemical determination of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine by a monoclonal antibody N45.1: Its application to ferric nitrilotriacetate-induced renal carcinogenesis model.
Laboratory Investigation, Vol. 76, No.3, p365-374, 1997
抗8-OHdGモノクローナル抗体(clone N45.1)の特異性に関する文献です。
3) M Kakimoto, T Inoguchi, T Sonta, HY Yu, M Imamura, T Etoh, T Hashimoto and H Nawata:
Accumulation of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine and mitochondrial DNA deletion in kidney of diabetic rats.
Diabetes, Vol. 51, p1588-1595, 2002
(糖尿病ラット腎を対象に、核/ミトコンドリアDNA中の8-OHdG測定例です。尿中8-OHdGも測定されています。)
4) D Nakae, Y Mizumoto, E Kobayashi, O Noguchi and Y Konishi:
Improved genomic / nuclear DNA extraction for 8-hydroxydeoxyguanosine analysis of small amounts of rat liver tissue.
Cancer Lett., Vol. 97, p233-239, 1995
(組織サンプルから8-OHdG測定用にDNA抽出する方法が記載されています。)
高感度8-OHdG Check ELISA 学術情報
 
酸化ストレスマーカー 組織/培養細胞8-OHdG測定プロトコール
ページの先頭へ