| 弊社8-OHｄG測定キットを使用した組織中8-OHｄG測定例をご紹介いたします。実施にあたっては実際にご使用になるサンプルに
合わせて実験条件をご検討ください。 |
| 2）DNA水溶液の濃度および純度検定 |
1）DNA水溶液の230nm、260nm、280nm、320nmにおける吸光度を分光光度計で測定し、
DNA水溶液の濃度、純度をチェックする。各波長の吸光度は320nmにおける吸光度をバックグラウンドとして差し引く。
2）DNA水溶液をDNA濃度が20〜50μg/mLとなるようにTEにて希釈し、各波長における吸光度を測定する。
【DNA濃度計算法】
260nmの吸光度1.0がDNA 50μg/mLに相当するので、以下のようにしてDNA濃度を算出する。
DNA濃度 ＝ 吸光度 X 50（μg/mL） X 希釈率
例）260nmにおける吸光度が0.55、320nmにおける吸光度が0.05の場合、DNA水溶液の濃度は
（0.55 − 0.05） * 50 * 50 ＝ 1250 （μg/mL）
【DNAの純度の目安】
（260nmの吸光度） ÷ （280nmの吸光度） ＝ 1.80〜1.85
高純度品の場合には（260nmの吸光度） ÷ （230nmの吸光度） ＝ 2.2〜2.5 |
|
| 3）DNAの加水分解 |
| 1) |
DNA200μｇを含むDNA水溶液に精製水を加えて135μＬにする。 |
| 2) |
200mM 酢酸ナトリウム(pH4.8) 15μL、1mg/mL nuclease P1を15μL（6unit）を加え、アルゴン置換後、
37℃で30分〜1時間インキュベートする。 |
| 3) |
Tris-HCl (1M, pH7.4)を15μL、200units/ 0.7mL alkaline phosphataseを7μL添加して、アルゴン置換後、
37℃にて1時間インキュベートする。 |
| 4) |
水解物を限外濾過フィルター（分画分子量10kDa）を用いて、14000rpm、10分間遠心して濾過する
（除蛋白処理）。 |
| 5) |
50μLのサンプル（計算上、53.5μｇのDNAに相当）をELISAプレートの各ウェルに分注して
測定すると2〜20nｇ/ｍLの範囲で測定可能。 |
| |
※加水分解を行ったサンプルは、当日中に測定してください。
※ TE: 1mM EDTA / 10mM Tris-HCl, pH8.0
※ 限外濾過フィルター：
日本ポール（株）製 ナノセップ オメガメンブレン（Code. OD010C34）等が利用可能です。
※ 使用する水は全てChelex処理を実施してください（ChelexはBioRad Laboratoriesの登録商標です）。 |
|
| 【参考文献】 |
| 1) |
ML Hamilton, Z Guo, CD Fuller, H Van Remmen, WF Ward, SN Austad, DA Troyer, I Thompson, A Richardson:
A reliable assessment of 8-oxo-2-deoxyguanosine levels in nuclear and mitochondrial DNA using the sodium iodide method to isolate DNA.
Nucleic Acids Res. Vol.29(10), p2117-2126, 2001
（NaI法によるDNA抽出に関する文献です。Phenol抽出では酸化が起きる可能性があることを示唆しています。） |
| 2) |
S Toyokuni, et. al.:
Quantitative Immunohistochemical determination of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine by a monoclonal antibody N45.1:
Its application to ferric nitrilotriacetate-induced renal carcinogenesis model.
Laboratory Investigation, Vol. 76, No.3, p365-374, 1997
抗8-OHdGモノクローナル抗体（clone N45.1）の特異性に関する文献です。 |
| 3) |
M Kakimoto, T Inoguchi, T Sonta, HY Yu, M Imamura, T Etoh, T Hashimoto and H Nawata:
Accumulation of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine and mitochondrial DNA deletion in kidney of diabetic rats.
Diabetes, Vol. 51, p1588-1595, 2002
（糖尿病ラット腎を対象に、核／ミトコンドリアDNA中の8-OHdG測定例です。尿中8-OHdGも測定されています。） |
| 4) |
D Nakae, Y Mizumoto, E Kobayashi, O Noguchi and Y Konishi:
Improved genomic / nuclear DNA extraction for 8-hydroxydeoxyguanosine analysis of small amounts of rat liver tissue.
Cancer Lett., Vol. 97, p233-239, 1995
（組織サンプルから8-OHdG測定用にDNA抽出する方法が記載されています。） |
|
|
|
 |
Copyright ©
JaICA. All rights reserved.
|
