酸化ストレスマーカー：血漿ニトロチロシン測定キット 3-nitrotyrosine ELISA for EDTA plasma【日本老化制御研究所】酸化ストレスマーカー/NO stress

Rev.131017

血漿ニトロチロシン測定キット
Nitrotyrosine ELISA

（酸化ストレス研究用試薬）

【数多くの疾病に関連するNOストレスマーカー】

　一酸化窒素（NO）は生体内において重要な生理機能を担う一方、NOはスーパーオキサイド（O₂^-）と反応することでパーオキシナイトライト（Peroxynitrite: ONOO^-）を形成し、活性窒素種（Reactive nitrogen species: RNS）として細胞や組織の障害に深く関わっていることが明らかにされつつあります¹⁾。

ニトロチロシン(3-nitrotyrosine: 3-NT)は、パーオキシナイトライトによる主要なタンパク質ニトロ化修飾物の一つであり、ニトロ化ストレス(nitrosative stress)マーカーとして広く用いられています。これまでにアルツハイマー、パーキンソン氏病、多発性硬化症、脳卒中などの神経疾患をはじめ、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈疾患、高血圧症など数多くの疾患との関連性が報告されています。

本キットはサンドイッチELISA法によりニトロシル化修飾タンパク質を測定します。

【キットの構成】

1.	マイクロプレート	96wells x 1枚（分割式・N=2での測定を推奨）
2.	スタンダード	5レベル　蒸留水500μLにて溶解します。
3.	アッセイバッファー	50mL　そのまま使用します。
4.	HRP-標識抗体	1本　使用直前に希釈済み洗浄液にて100倍希釈します。
5.	TMB基質液	15mL　そのまま使用します。
6.	反応停止液	15mL　そのまま使用します。
7.	洗浄液（x10濃縮）	100mL　蒸留水にて10倍希釈して使用します。
8.	コントロール	2レベル * 4本　蒸留水500μLにて溶解します。

品名	商品コード	測定波長	価格（税込）
血漿ニトロチロシン測定キット	KNT-150D	450nm	104,500円
ニトロチロシン受託検査	測定原理：ELISA法／最少検体数：10 検体提出量：血清/EDTA血漿1mL（最少0.5mL）		11,550円
ヒト血漿ニトロチロシン測定キット	KNT-029D	450nm	104,500円

【製造元】：Immundiagnostik AG, Germany
※製品の仕様、操作方法等は予告なく変更される場合があります。
特に操作方法につきましては、ご使用前に商品同梱の使用説明書を必ずご確認ください。

【ご注意】本製品は研究用試薬です。研究以外の用途（臨床検査/診断/医療行為等）には使用できません。

【製品仕様】

● 測定対象：	血清、血漿、便（ヒト・動物共に適用可能）
● 特異性：	ニトロシル化修飾タンパク質
● 測定レンジ：	～1500 nM
● 所要時間：	約4時間
● サンプル所要量：	50μL/well
● テスト数：	96 wells
● 必要な器具：	ピペットおよびチップ（50～1000μL可変容量）、蒸留水、試験管（15mL）、エッペンチューブ（1.5mL）、マイクロプレートリーダー（測定波長450nm）、プレートシェーカー、アルミホイル又はプレートシール
● 保存条件：	冷蔵（2～10℃ ・凍結不可）

【測定手順】

1.	使用する試薬を常温に戻しておきます。
2.	使用するウェルをフレームに取付け、残ったウェルは袋に密閉し冷蔵保管します。
3.	スタンダード、コントロール、及び試薬を調製します。尚、HRP-標識抗体は使用直前に必要量のみ希釈して調製します。
4.	血清サンプル50μLをエッペンチューブに入れ、アッセイバッファー200μLを添加混合します（5倍希釈）。便サンプルの場合は、使用説明書に従い、抽出処理を行ってから希釈、測定します。
5.	全てのウェルに希釈済み洗浄液 250μLを入れ、洗浄します。洗浄操作は 5回繰り返し、残液をよく取り除きます。
6.	スタンダード、コントロール、サンプルを100μL/ウェル分注します（N=2を推奨）。
7.	プレートに蓋をし、室温（18～26℃）にて2.5時間振とうします。
8.	液を捨て、希釈済み洗浄液 250μL/ウェルにて5回洗浄し、残液をよく取り除きます。
9.	希釈済みHRP-標識抗体試薬を100μL/ウェル分注します。
10.	プレートに蓋をし、室温（18～26℃）にて1時間振とうします。
11.	液を捨て、希釈済み洗浄液 250μL/ウェルにて5回洗浄し、残液をよく取り除きます。
12.	TMB基質液を100μL/ウェル分注します。
13.	暗所にて室温10～20分インキュベートします。
14.	反応停止液を100μL/ウェル分注します。
15.	450nmにおける吸光度を測定し、検量線を用いてニトロチロシン濃度を算出、希釈率（5倍）を掛けます。

【参考文献】

1)	Gonsette RE.; Neurodegeneration in multiple sclerosis: the role of oxidative stress and excitotoxicity. J Neurol Sci. 274(1-2), p48-53 (2008).
2)	Ischiropoulos H. ; Protein tyrosine nitration - an update. Arch Biochem Biophys. 484(2), p117-121 (2009)
3)	Peluffo G, Radi R.; Biochemistry of protein tyrosine nitration in cardiovascular pathology. Cardiovasc Res. 75(2), p291-302 (2007)
4)	Souza JM, Peluffo G, Radi R.; Protein tyrosine nitration--functional alteration or just a biomarker? Free Radic Biol Med. 45(4), 357-366 (2008)