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酸化ストレスマーカー技術情報
Technical support for oxidative stress biomarkers.  
こちらでは酸化ストレスマーカーの技術情報、学術情報をご紹介しております。皆様のご研究に役立てて頂ければ 幸いです。
またよろしければ、学会や論文等で発表された内容をご紹介頂ければ大変ありがたく思います。
ご質問・コメントなどお気軽にお送り頂けると助かります。 biotech@jaica.comまでお気軽にお知らせください。
対象となるマーカーも徐々に増やしていきたいと思います。どうぞよろしくお願い申し上げます。

弊社は本ホームページおよび製品、添付文書等を作成するにあたり細心の注意を払っておりますが、これらによる損害が万一発生した場合でも、 弊社は責を負いませんので予めご了承ください。また、製品の価格、仕様、試薬構成、測定手順等は、製造元の都合により予告無く変更される 場合があります。
分類 製品名 (下記をクリック)


New/高感度8-OHdG Check 技術情報 文献
抗8-OHdGモノクローナル抗体 技術情報 文献
抗TGモノクローナル抗体 技術情報 文献




ヘキサノイルリジン(HEL)測定キット 技術情報 文献
抗HELモノクローナル抗体 技術情報 文献
抗4-HNEモノクローナル抗体 技術情報 文献
尿中イソプラスタン測定キット 技術情報 文献
血清イソプラスタン測定キット 技術情報 文献
マロンジアルデヒド(MDA)測定キット 技術情報 文献
マロンジアルデヒド(MDA)ELISA測定キット 技術情報 文献
抗マロンジアルデヒド(MDA)抗体 技術情報 文献
ヒト酸化LDL 測定キット 技術情報 文献
ヒト酸化LDL 自己抗体測定キット 技術情報 文献
抗ヒト酸化LDL抗体 技術情報 文献
抗アクロレイン(ACR)抗体 技術情報 文献
抗4-HHEモノクローナル抗体 技術情報 文献
抗クロトンアルデヒド(CRA)抗体 技術情報 文献
抗7ケトコレステロール(7-KC)抗体 技術情報 文献
アクロレイン測定用ELISAキット(販売終了) 技術情報 文献

抗Nε-(carboxymethyl)lysine: CML抗体 技術情報 文献
抗メチルグリオキザール(MG)抗体 技術情報 文献




カルボニル化蛋白測定キット 技術情報 文献
カルボニル化蛋白測定キット(ヒト/動物用) 技術情報 文献
ヒト血清 カルボニル化蛋白質 測定キット 技術情報 文献
タンパク質過酸化物(AOPP)測定キット 技術情報 文献
血漿ニトロチロシン(NT)測定キット 技術情報 文献
ニトロチロシン(NT)測定キット 技術情報 文献
抗ニトロトリプトファン(NW)モノクローナル抗体 技術情報 文献
ジチロシン(DT)測定キット 技術情報 文献
抗ジチロシン(DT)モノクローナル抗体 技術情報 文献
抗ジブロモチロシン(DiBrY)モノクローナル抗体 技術情報 文献
分類 製品名 (下記をクリック)









SOD活性測定キット(比色法) 技術情報 文献
ヒトCu/Zn-SOD ELISAキット(SOD1) 技術情報 文献
ヒトMn-SOD ELISAキット(SOD2) 技術情報 文献
ヒトec-SOD ELISAキット(SOD3) 技術情報 文献
カタラーゼ活性測定キット(CAT) 技術情報 文献
グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)測定キット 技術情報 文献
グルタチオンレダクターゼ(GR)測定キット 技術情報 文献
ヒト細胞質GPx ELISAキット 技術情報 文献
GST-π測定キット 技術情報 文献
血清ミエロペルオキシダーゼ(MPO)測定キット 技術情報 文献
尿中ミエロペルオキシダーゼ(MPO)測定キット 技術情報 文献
血清MPO活性測定キット 技術情報 文献
PMNエラスターゼ測定キット 技術情報 文献









パラオキソナーゼ(arylesterase活性)測定キット 技術情報 文献
パラオキソナーゼ(paraoxonase活性)測定キット 技術情報 文献
チオレドキシン活性測定キット 技術情報 文献
ヒト チオレドキシンI ELISAキット 技術情報 文献
ヒト チオレドキシン還元酵素I ELISAキット 技術情報 文献
ペルオキシレドキシン活性測定キット 技術情報 文献
ヒト ペルオキシレドキシンI ELISAキット 技術情報 文献
ヒト ペルオキシレドキシンIII ELISAキット 技術情報 文献
チオールステータス測定キット 技術情報 文献
ヒト ミオスタチン測定キット 技術情報 文献



抗酸化能測定キット「PAO/PAO-U」 技術情報 文献
抗酸化能測定キット(油脂用)「PAO-SO」 技術情報 文献
グルタチオン測定キット 技術情報 文献
ビタミンC測定キット 技術情報 文献
ペルオキシルラジカル消去活性測定キット 技術情報 文献

14,15-DHET測定キット(高血圧研究マーカー) 技術情報 文献
     
     
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アクロレイン(ACR)測定用ELISAキット
No. 【タイトル】 【内容】
1 サンプルの前処理 尿サンプルを測定する場合には、付属の希釈液で10倍以上に希釈してから測定してください。 また、サンプルに濁りがある場合や 血球等の不溶物がある場合には、測定前に遠心分離(例:3000rpm * 10分)して濁り、 不溶物を除去してから希釈、測定してください。
2 開封後の有効期限 1次反応試薬、酵素標識抗体試薬は、調製後は冷蔵にて24時間保存できます。開封後は24時間以内に ご使用ください。
また、発色試薬は使用直前に必要量のみ調製してください。
3 油の酸化度測定 油脂サンプルに含まれるアクロレインを測定することが可能です。
1) 油脂サンプルに対し、BSA 1mg/mL PBSを添加します。
2) ホモジネート(例:ボルテックス2時間)
3) 油層/水層を分離させ、水層を回収します。
4) 水層画分をACR ELISAキットにて測定します。
(油の酸化度とほぼ相関する形で、ACRが検出されます)
4 組織サンプルへの適用 組織サンプル中のACR測定法は確立されておりませんが、下記の方法で測定できる可能性があります。
1) 組織サンプルを0.1% BHT/PBS中にホモジナイズします。
2) 遠心上清を回収し、ELISAに適用します。
5 血清サンプルへの適用 ACR ELISAキットの血清サンプルでの測定は確立されていないようです。検討される場合には再現性などに ご留意ください。
6 ACR測定キット販売終了の件 アクロレイン測定用ELISAキットにつきましては、開発製造元である日油株式会社様の事情により 2008年4月を以って販売を終了いたしました。ご愛用頂き誠にありがとうございました。

脂質酸化マーカーとしましては、「ヘキサノイルリジン測定キット」 がございます。ヘキサノイルリジン(ヘキサノニルリジン)は 1996年に大澤、加藤らによって見出された新規な酸化ストレスマーカーです。ω=6脂肪酸の酸化反応の初期段階で生成される 13-HPODEがタンパク質Lys残基に結合して形成される比較的安定な化合物であり、ヒト動脈硬化病巣において検出されるほか、 尿、血清中でも検出されています。本ELISAキットは尿、血清、血漿、培養細胞、組織サンプルに適用可能です。
ご質問などお気軽にどうぞ(メール)
【参考文献】
1) Koji Utida et al.,
Acrolein is a product of lipid peroxidation:formation of freeacrolein and its conjugate with lysine residues in oxidative low density lipoproteins.
J.Biol.Chem.,273,p16058(1998)
2) Koji Utida et al.
Protein-bound acrolein :Potential markers for oxidative stress.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95, p4882(1998)
3) Noel Y.Calingasar et al.
Protein-bound acrolein :A novel marker of oxidative stress in Alzheimer's disease.
J.Neurochemistry 72, p751(1999)
4) K.Satoh, et al.
A 1-hour enzyme-linked immunosorbent assay for quantitation of acrolein & hydroxynonenal-modified proteins by epitope-bound casein matrix method.
Analytical Biochemistry 270, p323-328 (1999)
5) Tsukahara H et al.
Oxidant and antioxidant activities in childhood meningitis.
Life Sci. 71(23),p2797-806 (2002)
6) Noiri E et al.
Serum protein acrolein adducts: utility in detecting oxidant stress in hemodialysis patients and reversal using a vitamin E-bonded hemodialyzer.
Free Radic Biol Med. 33(12),p1651-6 (2002)
7) Sukahara H
Formation of advanced glycosylation end products and oxidative stress in young patients with type 1 diabetes.
Pediatr Res. 54(3), p419-24(2003)
8) Daimon M et al.
Increased urinary levels of pentosidine, pyrraline and acrolein adduct in type 2 diabetes.
Endocr J. 50(1),p61-7 (2003)
9) Sakata K et al.
Increase in putrescine, amine oxidase, and acrolein in plasma of renal failure patients.
Biochem Biophys Res Commun. 305(1), p143-9 (2003)
10) Tsukahara H et al.
Oxidative stress in neonates: evaluation using specific biomarkers.
Life Sci. 75(8), p933-8 (2004)
11) Tomitori M. et al.
Polyamine oxidase and acrolein as novel biochemical markers for diagnosis of cerebral stroke.
Stroke, 36, p2609 (2005).
12) Shimizu K et al.
Examination of urine acrolein in Yusho victims.
Fukuoka Igaku Zasshi. 96(5), p214-5 (2005)
13) Hata I et al.
Urinary oxidative stress markers in young patients with type 1 diabetes.
Pediatr Int. 48(1), p58-61 (2006)
14) Igarashi K et al.
Physiological functions of polyamines and regulation of polyamine content in cells.
Yakugaku Zasshi. 126(7), p455-71 (2006)
15) Igarashi K et al.
Polyamines in renal failure.
Amino Acids. 31(4), p477-83 (2006)
16) Nakagawa N et al.
An oral adsorbent, AST-120, suppresses oxidative stress in uremic rats.
Am J Nephrol. 26(5), p455-61 (2006)
17) Tamura S et al.
Evaluation of a urinary multi-parameter biomarker set for oxidative stress in children, adolescents and young adults.
Free Radic Res. 40(11), p1198-205 (2006)
18) Taki K et al.
Indoxyl sulfate-lowering capacity of oral sorbents affects the prognosis of kidney function and oxidative stress in chronic kidney disease.
J Ren Nutr. 17(1), p48-52 (2007)
抗アクロレイン(ACR)抗体
No. 【タイトル】 【内容】
1 免疫組織染色への適用 1) ホルマリン固定パラフィン包埋切片(4〜6μm厚)を脱パラフィン処理します。
2) 3% H2O2に10〜20分間浸し、内因性ペルオキシダーゼを不活化させます。
3)正常血清または3% BSA / PBSにて室温30分間ブロッキング処理をします。
4)抗ACR抗体(推奨濃度0.5〜1.0μg/mL)にて4℃一晩反応させます。
5)PBSにて洗浄します。
6)ABC法(アビジン-ビオチンcomplex法)で染色します。発色基質にはDABを用います。
7)ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。

※1次抗体の希釈液:1% BSA, 0.1% NaN3, PBS pH7.6
※蛋白質分解酵素処理は、染色性を減弱させることがあります。
2 アクロレインの入手先 アクロレイン(アルデヒド)はSigma-Aldrich社より入手可能です。
Aldrich, code#110221 (Acrolein)
3 Western blotへの適用例 Modification by acrolein, a component of tobacco smoke and age-related oxidative stress, mediates functional impairment of human apolipoprotein E.
Tamamizu-Kato S, et. al. Biochemistry. 46(28), p8392-8400(2007)
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【参考文献】
1) Protein-bound acrolein: Potential markers for oxidativestress.
K.Uchida, M.Kanematsu, K.Sakai, T.Matsuda, N.Hattori,Y.Mizuno, D.Suzuki,T.Miyata, N.Noguchi, E.Niki,T.Osawa
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,4882-4887(1998)
2) Protein-bound acrolein: A novel markers of oxidativestress in Alzheimer's Disease.
Noel Y. Calingasan, Koji Uchida, and Gary E.Gibson
Journal of Neurochemistry.72(2),751-756(1999)
3) A 1-Hour Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Quantitation of Acrolein- and Hydroxynonenal- Modified Proteins by Epitope-Bound CaseinMatrix Method.
K.Satoh,S.Yamada,Y.Koike,Y.Igarashi,S.Toyokuni,T.Kumano,T.Takahata,S.Tsuchida and K.Uchida
Analytical Biochemistry.270,323-328(1999)
4) Red blood cells inhibit activation-induced cell death and oxidative stress in human peripheral blood T lymphocytes.
Fonseca AM, Porto G, Uchida K, Arosa FA.
Blood. 97(10), p3152-60 (2001)
5) Thiolation of protein-bound carcinogenic aldehyde. An electrophilic acrolein-lysine adduct that covalently binds to thiols.
Furuhata A, Nakamura M, Osawa T, Uchida K.
J Biol Chem. 277(31), p27919-27926 (2002)
6) Tissue distribution of lipid peroxidation product acrolein in human colon carcinogenesis.
Kamelija Zarkovic, Koji Uchida, Danijela Kolenc, Ljiljana Hlupic, Neven Zarkovic
Free Radical Research, 40(6), p543 - 552 (2006)
結腸ガン組織におけるアクロレインの免疫組織染色
7) Modification by acrolein, a component of tobacco smoke and age-related oxidative stress, mediates functional impairment of human apolipoprotein E.
Tamamizu-Kato S, Wong JY, Jairam V, Uchida K, Raussens V, Kato H, Ruysschaert JM, Narayanaswami V.
Biochemistry. 46(28), p8392-8400(2007)
アクロレイン処理したApoE蛋白を対象にウェスタンブロットに適用しています。
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抗マロンジアルデヒド(MDA)抗体
No. 【タイトル】 【内容】
1 免疫組織染色プロトコル

1)ホルマリン固定パラフィン包埋切片(4〜6μm厚)を脱パラフィン処理します。
2)3% H2O2にて10〜20分処理し、内因性ペルオキシダーゼを不活化します。
3)PBS(pH7.6)にて5分間 X 3回洗浄します。
4)正常血清または3% BSA / PBSにて室温30分間ブロッキング処理します。
5)抗MDA抗体を希釈液(1% BSA, 0.1% NaN3, PBS pH7.6)にて100〜200倍に希釈し、4℃一晩反応させます。
6)ABC法(アビジン-ビオチンcomplex法)にて染色します。発色基質にはDABを用います。
7)ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。

※48時間以上固定処理したサンプルでは、染色性が低下する場合があります。
蛋白質分解酵素処理は染色性を低下させる場合があります。

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【参考文献】
1) Immunochemical detection of a lipofuscin-like fluorophore derivered from malondialdehyde and lysine.
S Yamada, S Kumazawa, T Ishii, T Nakayama, K Itakura, N Shibata, M Kobayashi, K Sakai, T Osawa and K Uchida.
J.Lipid Res. 42, p1187-1196 (2001)
2) Investigation on the Origin of Sperm DNA Fragmentation: Role of Apoptosis, Immaturity and Oxidative Stress.
Muratori M, Tamburrino L, Marchiani S, Cambi M, Olivito B, Azzari C, Forti G, Baldi E
Mol Med. 21,p109-122(2015). doi: 10.2119/molmed.2014.00158.
精子を抗MDA抗体で染色し、フローサイトメトリー解析
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抗メチルグリオキザール(MG)抗体
No. 【タイトル】 【内容】
1 免疫組織染色プロトコル 1)ホルマリン固定パラフィン包埋切片(4〜6μm厚)を脱パラフィン処理します。
2)3% H2O2にて10〜20分処理し、内因性ペルオキシダーゼを不活化します。
3)PBS(pH7.6)にて5分間 X 3回洗浄します。
4)正常血清または3% BSA / PBSにて室温30分間ブロッキング処理します。
5)抗MG抗体を希釈液(1% BSA, 0.1% NaN3, PBS pH7.6)にて100〜200倍に希釈し、4℃一晩反応させます。
6)ABC法(アビジン-ビオチンcomplex法)にて染色します。発色基質にはDABを用います。
7)ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。

※48時間以上固定処理したサンプルでは、染色性が低下する場合があります。
蛋白質分解酵素処理は染色性を低下させる場合があります。
2 ウェスタンブロットへの適用 本抗体はウェスタンブロットにも適用可能です。
参考文献:Argpyrimidine, a blue fluorophore in human lens proteins: high levels in brunescent cataractous lenses.
Padayatti PS, Ng AS, Uchida K, Glomb MA, Nagaraj RH
Invest Ophthalmol Vis Sci. 42(6), p1299-1304. (2001)ヒト レンズ蛋白質の研究例
3 免疫沈降への適用 本抗体は蛋白質のアルギニン残基とメチルグリオキサールが反応したアルグピリミジン構造を 認識します。このため、免疫沈降で検出される蛋白質は、特定の蛋白質だけではなく、アルギニン残基を持つ 複数の蛋白質である可能性が考えられます。尚、本抗体を用いた免疫沈降の具体的な実施例は、弊社では 把握しておりません。
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【参考文献】
1) Protein modification by a Maillard reaction intermediate methylglyoxal. Immunochemical detection of fluorescent 5-methylimidazolone derivatives in vivo.
Uchida K, Khor OT, Oya T, Osawa T, Yasuda Y, Miyata T
FEBS Lett. 410(2-3), p313-318. (1997)
2) Immunological evidence for methylglyoxal-derived modifications in vivo.
Farrukh A Shamsi, Andreea Partal, Candase Sady, Marcus A Glomb and Ramanakoppa H Nagaraj
J. Biol. Chem., 273(12), p6928-6936 (1998)
MethylglyoxalをELISAにて検出した研究例です。
3) Methylglyoxal Modification of Protein -Chemical and Immunochemical Characterization of Methylglyoxal-Arginine Adduct.
T.Oya, N.Hattori, Y.Mizuno, S.Miyata, S.Maeda, T.Osawa and K.Uchida
J. Biol. Chem., 274, 18492-18502 (1999)
4) Advanced glycation and lipidoxidation of the peritoneal membrane: respective roles of serum and peritoneal fluid reactive carbonyl compounds.
Miyata T, Horie K, Ueda Y, Fujita Y, Izuhara Y, Hirano H, Uchida K, Saito A, van Ypersele de Strihou C, Kurokawa K
Kidney Int. 58(1), p425-435.(2000)
5) Argpyrimidine, a blue fluorophore in human lens proteins: high levels in brunescent cataractous lenses.
Padayatti PS, Ng AS, Uchida K, Glomb MA, Nagaraj RH
Invest Ophthalmol Vis Sci. 42(6), p1299-1304. (2001)
6) High concentrations of glucose induce synthesis of argpyrimidine in retinal endothelial cells.
Padayatti PS, Jiang C, Glomb MA, Uchida K, Nagaraj RH
Curr Eye Res. 23(2), p106-115. (2001)
7) Curcumin Inhibits ROS Formation and Apoptosis in Methylglyoxal-Treated Human Hepatoma G2 Cells.
WEN-HSIUNG CHAN, HSIN-JUNG WU and YAN-DER HSUUW
Ann. N.Y. Acad. Sci. 1042: 372-378 (2005)
8) Heat-shock protein 27 is a major methylglyoxal-modified protein in endotherial cells.
Casper G Schalkwijk, Jan van Bezu, Roel C van der Schors, Koji Uchida, Coen DA Stehouwer, Victor WM van Hinsbergh.
FEBS Lett. 580, p1565-1570 (2006)
Erratum to: "Heat-shock protein 27 is a major methylglyoxal-modified protein in endotherial cells."
FEBS Lett. 580, p2400 (2006)
血管内皮細胞においてHSP27がメチルグリオキザール修飾されることが報告されています。
9) Methyl glyoxal elevation is associated with oxidative stress in rheumatoid arthritis.
S. Mukhopadhyay, S. Sen, B. Majhi, K. P. Das, M. Kar
Free Radical Research 41(5) p507-514(2007)
関節リウマチ患者148名および正常対照群88名を対象とした研究。関節リウマチ患者においてメチルグリオキザール(MG) はTBARS値上昇およびGSH減少に関連して上昇することが報告されています。
10) Oxidative stresses induced by glycoxidized human or bovine serum albumin on human monocytes.
Philippe Rondeau, Nihar Ranjan Singh, Henri Caillens, Frank Tallet and Emmanuel Bourdon
Free Radical Biology and Medicine 45(6), p799-812 (2008)
MG修飾されたアルブミンはヒト単球を刺激して酸化ストレスを亢進させることが報告されています。
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抗クロトンアルデヒド(CRA)抗体
No. 【タイトル】 【内容】
1 免疫組織染色プロトコル 1)ホルマリン固定パラフィン包埋切片(4〜6μm厚)を脱パラフィン処理します。
2)3% H2O2にて10〜20分処理し、内因性ペルオキシダーゼを不活化します。
3)PBS(pH7.6)にて5分間 X 3回洗浄します。
4)正常血清または3% BSA / PBSにて室温30分間ブロッキング処理します。
5)抗CRA抗体を希釈液(1% BSA, 0.1% NaN3, PBS pH7.6)にて100〜200倍に希釈し、4℃一晩反応させます。
6)ABC法(アビジン-ビオチンcomplex法)にて染色します。発色基質にはDABを用います。
7)ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。

※48時間以上固定処理したサンプルでは、染色性が低下する場合があります。
蛋白質分解酵素処理は染色性を低下させる場合があります。
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【参考文献】
1) Endogenous formation of protein adducts with carcinogenic aldehydes.
K Ichihashi, T Osawa, S Toyokuni, K Uchida: J Biol Chem 276(26), p23903-23913 (2001)
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抗4-ヒドロキシ-2-ヘキセナール(4-HHE)抗体
No. 【タイトル】 【内容】
1 免疫組織染色プロトコル 1)ホルマリン固定パラフィン包埋切片(4〜6μm厚)を脱パラフィン処理します。
2)3% H2O2にて10〜20分処理し、内因性ペルオキシダーゼを不活化します。
3)PBS(pH7.6)にて5分間 X 3回洗浄します。
4)正常血清または3% BSA / PBSにて室温30分間ブロッキング処理します。
5)抗4-HHE抗体を希釈液(1% BSA, 0.1% NaN3, PBS pH7.6)にて100〜200倍に希釈し、4℃一晩反応させます。
6)ABC法(アビジン-ビオチンcomplex法)にて染色します。発色基質にはDABを用います。
7)ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。

※48時間以上固定処理したサンプルでは、染色性が低下する場合があります。
蛋白質分解酵素処理は染色性を低下させる場合があります。
2 Western blottingへの適用 本抗体はウェスタンブロッティングにも適用可能です。使用する1次抗体濃度は、実験条件によりますが 1μg/mL程度で染まることが多いようです。
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【参考文献】
1) Protein-bound 4-hydroxy-2-hexenal as a marker of oxidized n-3 polyunsaturated fatty acids.
Yamada S, Funada T, Shibata N, Kobayashi M, Kawai Y, Tatsuda E, Furuhata A, Uchida K.
J Lipid Res. 45(4), p626-634 (2004)
2) Accumulation of protein-bound 4-hydroxy-2-hexenal in spinal cords from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis.
Shibata N, Yamada S, Uchida K, Hirano A, Sakoda S, Fujimura H, Sasaki S, Iwata M, Toi S, Kawaguchi M, Yamamoto T, Kobayashi M
Brain Res. 1019(1-2), p170-177 (2004)
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抗7-ケトコレステロール(7-KC)抗体
No. 【タイトル】 【内容】
1 適用可能な組織サンプル 7-KCの免疫組織染色サンプルには、凍結切片をご用意ください。パラフィン包埋サンプルは適用できません。 これは7-KCは溶剤に溶解してしまうためです。凍結切片の作製は下記のように行います。
1) 組織サンプルを20%ホルマリンで固定します。
2) 30%ショ糖に浸し、組織中の固定液をショ糖液に完全に置換します。
3) ドライアイスアセトン上でOCTコンパウンドに凍結包埋し、クリオスタットを用いて凍結切片を作製します。
2 免疫組織染色プロトコル 1)OCTコンパウンド包埋 凍結組織から包埋切片(3〜7μm厚)を作製します。
2)凍結切片をPBS(pH7.6)で洗浄し、OCTコンパウンドを除去します。
3)1% EDTAを含む3% H2O2/PBSにて15分間、内因性ペルオキシダーゼの不活化処理をします。
4)PBS(pH7.6)にて洗浄します。
5)正常血清(3%)にて室温30分間、ブロッキング処理をします。
6)PBS(pH7.6)にて洗浄します。
7)内因性アビジンビオチン活性を不活化させます。
8)PBS(pH7.6)にて洗浄します。
9)抗7-KC抗体を希釈液(1% BSA, 0.1% NaN3, 1.5mM EDTA, 10mM PBS pH7.6)にて希釈し、4℃一晩反応させます。
10) ABC法(アビジン-ビオチンcomplex法)にて染色します。発色基質にはDABを用います。
11)ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。
3 サンプル固定条件 5mm厚以内に切り出した新鮮組織の固定には、20%ホルマリン中にて24〜48時間以内の固定が望ましい。
4 過酸化水素処理の際のEDTAについて MilliQ水であれば通常EDTAを添加する必要はありませんが、EDTAの有無により染色性に影響が出る場合には 過酸化水素処理の際に1% EDTAを添加することをお奨めします。
5 内因性アビジンビオチンのブロッキング Vector社よりブロッキングキットが市販されておりますので、ご利用ください。
6 2次抗体について 使用するキットによって異なります。例えばウサギ 抗マウスIgGやヤギ 抗マウスIgGを5000〜10000倍希釈して 室温にて2時間程度反応させます。詳しくはご利用になるABCキットの説明書をご参照ください。
7 サンプル切片の厚さ なるべく3〜7μm厚に調製することをお奨めします。特に20μm厚を超えると、浸透性が悪くなる可能性が 考えられます。
8 エステル化7-KCについて 本抗体のエステル化7-KCの反応性について、試験データはありません(エステル化7-KCは水に不溶のため 検証困難であることが理由です)。本抗体はヒドロキシル基も認識すると考えられており、エステル化された7-KCは 認識しない可能性が高いと推測されます。
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【参考文献】
1) Oxysterol mixtures, in atheroma-relevant proportions, display synergistic and proapoptotic effects.
Free Radical Biology and Medicine, 41(6), p902-910 (2006)
David A. Larsson, Sarah Baird, Jerome Diinga Nyhalah, Xi-Ming Yuan and Wei Li
7-KCの細胞毒性に関する文献です。7-KCは酸化LDLやアテローム性動脈硬化病変部位に存在し、細胞毒性を示します。
2) In vivo interconversion of 7β-hydroxycholesterol and 7-ketocholesterol, potential surrogate markers for oxidative stress.
Free Radical Biology and Medicine 43(5), p695-701(2007)
Hanna Larsson, Ylva Bottiger, Luigi Iuliano and Ulf Diczfalusy
7β-hydroxycholesterol と 7-ketocholesterolはヒト生体内において相互変換することが示されています。 重水素標識した7-ketocholesterolを健常者ボランティア2名に静注。7-ketocholesterolの血中半減期は1.5時間。
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