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「New 8-OHdG Check」ELISAキット測定法のチェックポイント  
「New 8-OHdG Check」ELISAキットはどなたでも簡単にご利用頂けます。ご使用にあたってのチェックポイントをご紹介いたします。
他のELISAキットにも共通する部分もありますので、より精度の高いデータを得るための参考にして頂ければ幸いです。

※「高感度8-OHdG Check」など製品によってそれぞれプロトコルや反応条件が異なります。
ご使用の前にキットに同梱されている使用説明書を よくお読みください。
【「New 8-OHdG Check」ELISAキットの使用手順】
■キットを測定前に取り出し、室温に戻しておきます(1時間程度)。
必要な試薬のみ取り出して、残りは冷蔵保存しておきます。

※今回使用しないウェルはこの時点で分割して外しておいてください。
分割したウェルは袋に入れて密封。2週間以内に使用してください。

■マイクロプレート裏側の乾燥剤を取り外し、今回使用しないウェルは予め取り外しておきます。
【固相化プレートの準備】
【サンプル分注】
■分注前に1次抗体試薬を調製しておきます。

■サンプルを正確に50μL/ウェル分注します。(分注精度が測定精度に大きく影響します)

※上下2行は“エッジ効果”により計測誤差が出る場合があります。

※最初にサンプル、次に1次抗体試薬の順に分注するよう、順序にご注意ください。分注順序が逆になると測定できなくなる場合があります。
【1次抗体分注】
■1次抗体試薬を、ブランクウェルを除く全てのウェルに正確に50μL/ウェル分注します(反応開始)。
ブランクウェルにはPBSまたは洗浄液を100μL入れておきます。

※ウェルの底面および側面(底面から5mmまで)には8-OHdG抗原が固相化されております。ピペットチップの先端が接触すると固相化抗原が剥がれ、 測定誤差の原因となる場合があります。
■横方向に軽くタッピングしてウェル内部を混合します。
(液が溢れないよう注意し、横方向に3~5回軽く揺すります)
【1次抗体反応】
■プレートをシールします。
しっかり密着させ密封してください。

■37℃に調整した恒温槽またはインキュベーターに入れ、1時間静置。
時間が延びないようご注意ください。

※インキュベーターの機種により温度ムラ、温度変動があり、再現性低下の原因となります。また温度が37℃より高いと異常反応 (非特異的な発色など)の原因となります。データが安定しない場合には恒温槽のご使用をお奨めします。

■2次抗体試薬を調整します。
■プレートからシールを剥がします。 剥がしたシールはもう一度使いますので保存しておきます。シールに液滴が付いている場合にはキムワイプ等で取り除いてください。
【洗浄】以下の手順を3回繰り返します。
■両サイドからしっかりフレームを押さえ、ウェルが外れないように
持ちます。

【自動洗浄器にご注意】
自動洗浄器をご使用になられると機種によりバックグラウンドが上昇する場合があります。手作業による洗浄をおすすめします。 2つの原因が考えられます。多くの機種では洗浄ノズルが1~2列であるために、ノズル先端に隣接するウェルの1次抗体が隣接するウェルに コンタミネーションを起こす場合があります。この場合の特徴としてバックグラウンドの上昇、ウェルの洗浄順序に対応して吸光度勾配が 観察されます。2点目は洗浄液の残留です。本キットは競合ELISA法を原理としており、ウェルに結合/遊離したごく微量の1次抗体を検出します。 このため試薬の分注精度や1次抗体のコンタミネーションに対して非常に繊細です。
■マイクロプレートを逆さに持って腕を振り、ウェル内の液を一気に
捨てます。

【ここは特にご注意ください】
再現性、ブランク吸光度に影響を与える場合があります。本試薬は競合型ELISA系であることから、 原理的に1次抗体の分注精度およびセル間の コンタミネーションに対して繊細です。少量の1次抗体と試料中の8-OHdGとを反応させ、残存したフリーの1次抗体を検出しています。 つまり1次反応終了後に、隣接するウェルからの1次抗体のコンタミネーションが起きると、そのウェルの吸光度が異常に上昇することになります。 このコンタミネーションの影響は、特にブランク吸光度の異常上昇として観察されることがあります。

【きれいなデータのためのコツ】
1) 勢いをつけて一気に液を出し切る。この時点で液滴が殆ど残らないように勢いよく液を切ることがポイントです。
2) 液を捨てたあとはウェルを下向きにしたまま直ちに清潔なキムタオルに乗せ液滴を取り除く。擦らないようにしてください。 また、キムタオルで液を吸い取る前に、ウェルを上向きにするとコンタミが起きる場合があります。
3) キムタオルに数回叩きつけて液をしっかり切ります。ウェルとウェルの間に液が入ってしまった場合には出来るだけ取り除いてください。

■清潔なキムタオル等に5回程度垂直に叩きつけて、ウェル内部に
水滴が残らないように除去します。

※ウェル内部は乾かさないように注意してください。ウェル内部には
触れないでください。

キムタオルが汚れた場合には新しいものと交換してください。キムタオルが汚れているとウェル間のコンタミの原因となる場合があります。
■8連ピペットにて洗浄液を250μL/ウェル分注します
(排液から3分以内に完了。ウェルを乾燥させないこと)

※ウェル内が乾燥すると非特異的な吸光度上昇の原因となる
場合があります。

【1回目の洗浄では特にご注意ください】
先程の排液ステップの所で説明しましたように、本キットは競合ELISA法を原理としており、ウェルに結合/遊離したごく微量の1次抗体を 検出します。このため試薬の分注精度や1次抗体のコンタミネーションに対して非常に繊細です。洗浄液の分注時にピペット先端がウェルに 接触すると隣接するウェルから1次抗体のコンタミネーションが発生する場合があります。このときにはバックグラウンドの上昇や、 低濃度サンプルのマイナス測定値(サンプルウェルの吸光度上昇)が観察されます。
■軽く揺すって洗浄液をなじませます。

■以上の洗浄操作を3回繰り返します。
最後に洗浄液を捨てて、水滴を除去します。新しいキムタオルに5回
程度叩きつけて、ウェル内部に水滴が残らないようにします。
【2次抗体分注】
■2次抗体試薬を100μL/ウェル分注します。
(洗浄液の排液から3分以内に完了します。ウェルを乾燥させないこと)
■横方向に軽くタッピングしてウェル内部を混合します。
(液が溢れないよう注意し、横方向に3~5回軽く揺すります)
【2次抗体反応】
プレートをシールします。
しっかり密着させ密封してください。

■37℃に調整した恒温槽またはインキュベーターに入れ、1時間静置。
時間が延びないようにご注意ください。

※機種により温度ムラ、温度変動があり、再現性低下の原因となります。また温度が37℃より高いと異常反応(非特異的な発色など)の 原因となります。データが安定しない場合には恒温槽のご使用をお奨めします。
【洗浄】以下の手順を3回繰り返します。
■両サイドからしっかりフレームを押さえ、ウェルが外れないように
持ちます。
■マイクロプレートを逆さに持って腕を振り、ウェル内の液を一気に
捨てます。

■清潔なキムタオル等に5回程度叩きつけて、ウェル内部に水滴が
残らないように除去します。

※ウェル内部は乾かさないように注意してください。ウェル内部には
触れないでください。

※キムタオルは毎回、きれいな面に取り替えてください。キムタオルに付着した2次抗体がウェルにコンタミすると、 異常発色の原因となる場合があります。
■8連ピペットにて洗浄液を250μL/ウェル分注します
(排液から3分以内に完了。ウェルを乾燥させないこと)

※ウェル内が乾燥すると非特異的な吸光度上昇の原因となる
場合があります。

■軽く揺すって洗浄液をなじませます。


■以上の洗浄操作を3回繰り返します。
最後に洗浄液を捨てて、水滴を除去します。新しいキムタオルに5回
程度叩きつけて、ウェル内部に水滴が残らないようにします。

※3回目の洗浄時には必ず新しいキムタオルに交換してください。


■発色試薬を調整しておきます。

■液滴が残っていないかチェックしてみてください。

※ここで液滴が残っていると、発色異常や、ばらつきの原因になります。
【発色試薬分注】
■8連ピペットにて発色試薬をを100μL/ウェル分注します
(排液から3分以内に完了。ウェルを乾燥させないこと)

※ウェル内が乾燥すると非特異的な吸光度上昇の原因となる
場合があります。
■横方向に軽くタッピングしてウェル内部を混合します。
(液が溢れないよう注意し、横方向に3~5回軽く揺すります)
【発色反応】
■室温(20~25℃)にて遮光して15分間インキュベート。
時間が延びないようにご注意ください。

※室温等の条件により発色が進みすぎる場合には、インキュベート時間を10分~13分程度に短縮すると最適な検量線が得られます。
■反応停止液を100μL/ウェル分注し、軽く揺すって攪拌します。
■マイクロプレートリーダーを使って450nmの吸光度を測定します。
片対数方眼紙などを使って、検量線を作成し、サンプル中の8-OHdG
濃度を算出します。
【典型的な検量線】
室温等の実験条件により、検量線(0.5ng/mL)の吸光度が1.4~2.0の範囲にあれば正常です。
【トラブルシューティング】
吸光度が全体に高い(検量線はきれいに引けている)場合 ⇒発色時間を15分から少し短かめにしてみてください。
ブランクの吸光度が高い(通常は0.02~0.07程度に収まります)場合 ⇒2次抗体の洗浄プロセスを見直してみてください。
異なるロットの試薬を混合したり、組み合わせたりしないでください。
サンプルの前処理は適切に行ってください。凍結した尿サンプルは融解すると不溶物を発生することがあります。
この場合は測定直前に軽く遠心し、不溶物を除去してから測定してください。
血清など高分子成分を含むサンプルの場合には、前処理として限外濾過による高分子成分の除去が必要です。
測定値のばらつきを抑える為に、N=3以上での測定をお奨めします。
異常値が疑われる場合には、PBSにて2~4倍に希釈してから測定してみてください。
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