日本老化制御研究所酸化ストレスマーカー：抗4-HNE抗体免疫組織染色プロトコル脂質過酸化マーカー4-ヒドロキシノネナールの検出

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Rev.090316

弊社抗4-HNE抗体を使用した免疫組織染色実施例をご紹介いたします。
実施にあたっては実際にご使用になるサンプルに合わせて実験条件をご検討ください。

● 固定：	ブアン固定が好ましい。「抗原賦活プロセス」は不要です。ホルマリン固定した組織や培養細胞では「抗原賦活プロセス」を入れることで染色性が改善される場合があります。
● 使用濃度：	10～20μｇ/ｍL
● 反応条件：	4℃、一晩
● ブロッキング：	DAKO社ウサギ血清 ※ブロッキングには、ご使用になる2次抗体と同じ動物種の正常血清をご使用ください。 Rabbit Anti mouse IgGの場合にはウサギ血清が適しています。
● 染色法：	ABC法（Vector Laboratories社・Avidin-Biotin-complex法）アルカリホスファターゼ（AP）希釈率＝100倍基質＝黒色（Vector Laboratories社・BlackまたはBCIP/NBT Substrate Kit）

抗原賦活プロセス：

電子レンジを用いる方法：

1)	500ｍLガラスビーカーにスライドと10ｍMクエン酸バッファ（pH6.0）を入れ、アルミホイルでふたをし、 ”調理（電子レンジ強）”で沸騰するまで加熱する。スライドグラスが剥がれないように、セランコート処理したものを用いる。
2)	沸騰後、更に加熱し5分間沸騰させる。
3)	1時間ほどかけて徐冷する。※急冷しないこと。
4)	ABC法にて染色を行う。

オートクレーブを用いる方法：

上記電子レンジを用いる方法と同様とし、加熱条件を121℃10分間とする。

抗原賦活化処理について：

抗原賦活化処理の必要性は、組織の種類や状態に依存します。特にホルマリンで長時間固定したサンプル
では、抗原賦活化処理によって染色性が改善される場合があります。組織の種類により、賦活化処理を
実施しなくても良い染色像が得られるケースがあるようです。

【参考文献】

1)	T.Tanaka, Y.Nishiyama, K.Okada, K.Hirota, M.Matsui, J.Yodoi, H.Hiai, and S.Toyokuni: Induction and nuclear translocation of thioredoxin by oxidative damage in the mouse kidney: independence of tubular necrosis and sulfhydryl depletion. Lab. Invest. 77(2), p145-155 (1997) マウス腎における免疫組織染色
2)	S.Toyokuni, N.Miyake, H.Hiai, M.Hagiwara, S.Kawakishi, T.Osawa and K.Uchida: The monclonal antibody specific for the 4-hydroxy-2-nonenal histidine adduct. FEBS Lett. 359, p189-191 (1995) ウェスタンブロッティング法への適用例
3)	Differential Effects of High Glucose and Methylglyoxal on Viability and Polyol Metabolism in Immortalized Adult Mouse Schwann Cells. Kazunori Sango, Hiroko Yanagisawa, Koichi Kato, Noriaki Kato, Hiroko Hirooka, Kazuhiko Watabe Open Diabetes J. 1, p1-11(2008) 培養細胞を対象にした4-HNEの染色例です（ご教示いただきました三五先生に深謝申し上げます）。

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