こちらでは酸化ストレスマーカーの技術情報、学術情報をご紹介しております。皆様のご研究に役立てて頂ければ
幸いです。
またよろしければ、学会や論文等で発表された内容をご紹介頂ければ大変ありがたく思います。
ご質問・コメントなどお気軽にお送り頂けると助かります。
biotech@jaica.comまでお気軽にお知らせください。
対象となるマーカーも徐々に増やしていきたいと思います。どうぞよろしくお願い申し上げます。
弊社は本ホームページおよび製品、添付文書等を作成するにあたり細心の注意を払っておりますが、これらによる損害が万一発生した場合でも、
弊社は責を負いませんので予めご了承ください。また、製品の価格、仕様、試薬構成、測定手順等は、製造元の都合により予告無く変更される
場合があります。 |
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| ヘキサノイルリジン測定用ELISAキット |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
適用可能な動物種 |
ヒト、ウサギ、ラットなど幅広い動物種に適用可能と考えられます。2004/06時点ではヒト尿、イヌ尿、
ネコ尿への 適用例があります。 ヘキサノイルリジンの研究事例をひろく集めて、皆様のご研究に役立てたいと考えております。
⇒ぜひ実験例をbiotech@jaica.comまでご一報ください。どうぞよろしくお願い申し上げます。
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| 2 |
ヒト尿サンプルの
測定例（健常者） |
PBSにて4倍程度の希釈をお奨めします。
・尿中HEL濃度（105.4±67.0 nmol/L）
・尿中HEL濃度（85.1±61.8 pmol/mg CRE）クレアチニン補正
・尿中HEL濃度（77.2±54.9 pg/hour kg）生成速度補正 |
| 3 |
ヒト血清サンプルの
測定例（健常者） |
前処理（プロテアーゼ処理）を行うことで、血清中のHELを検出できます。
【測定手順】：
1) 血清サンプルをPBSにて2倍希釈します。
2) 希釈血清300μLに対しαキモトリプシン溶液（14mg/mL in PBS）60μL添加。
（αキモトリプシン溶液は-80℃にて凍結保存できます。凍結融解の繰り返しは避けてください。）
3) 37℃1晩インキュベート
4) 限外濾過膜（分画分子量10kDa）を通過させる（プロテアーゼ除去）
例： 日本ポール（株）製 ナノセップ遠心ろ過デバイス オメガメンブレン（Code. OD010C34）
5) 限外濾過の濾液をHEL測定ELISAキットにて測定
【参考値】：
健常者ヒト血清中HEL濃度 7.96±4.32 nmol/L |
| 4 |
動物由来サンプルの測定 |
・イヌ尿HEL：PBSにて4倍程度の希釈をお奨めします。参考値 14〜58 nmol/L
・ネコ尿HEL：PBSにて10倍程度の希釈をお奨めします。参考値 108〜298 nmol/L
・マウス尿HEL： PBSにて20倍程度の希釈をお奨めします。
・ラット血清HEL：ヒト血清と同様にプロテアーゼ処理して測定します。参考値 25.8 nmol/L |
| 5 |
酸化LDLの測定 |
精製ヒトLDLをin vitroにて酸化処理するとHELが検出されます。
【測定手順】：
1) 精製LDL画分または酸化LDLをPBS(pH7.4)に透析します。
2) サンプル100μLに対しTrypsin溶液100μL(40mg/mL)およびCaCl2水溶液(100mM)2μL添加。
3) 37℃1晩インキュベート
4) 分画分子量10kDaの限外濾過フィルターにて限外濾過処理（Trypsin除去）
5) 限外濾過の濾液をHEL測定ELISAキットにて測定
【測定結果】：native human LDL=13.6 nmol/L, oxidized human LDL=363.6 nmol/L |
| 6 |
組織サンプルへの適用 |
組織中のHELをELISAにて測定した文献はまだ無いようですが、下記の方法にて測定できる可能性があります。是非お試しください。
【測定手順】：
1) 組織サンプルを0.1% BHT (butylated hydroxytoluene)を含むPBS中にホモジネート
2）遠心上清を回収し、可溶化画分とします
3) 可溶化画分300μLに対しαキモトリプシン溶液（14mg/mL in PBS）60μL添加。
4) 37℃1晩インキュベート
5) 分画分子量10kDaの限外濾過膜を通過させる（プロテアーゼ除去）
6) 限外濾過の濾液をHEL測定ELISAキットにて測定
※BHTは大変水に溶けにくいのでエタノール中に溶かしてからPBSに添加します。PBSや水に添加したときに濁りを生じる場合が
あります。この場合には、予めBHT/PBS溶液を作りおきするのではなく、ホモジネートを開始する 直前にBHTエタノール溶液を
添加混合してそのまま 直ちにホモジネートを開始することをお奨めします。 |
| 7 |
培養細胞でのHEL定量 |
培養細胞中のHELにつきましては下記の方法にて測定できる可能性があります。是非お試しください。
【測定手順】：
1）コンフルエントに達するまで培養（6穴プレート）
2）無血清培地に置換し、酸化ストレス負荷
3）PBSにて3回洗浄
4）PBS 600μL中に、スクレイパーにて細胞を回収
5) 細胞懸濁液に0.1% BHT (butylated hydroxytoluene)を加え、ソニケーターにて破砕
6）遠心上清を回収し、可溶化画分とします
7) 可溶化画分300μLに対しαキモトリプシン溶液（14mg/mL in PBS）60μL添加。
8) 37℃1晩インキュベート
9) 分画分子量10kDaの限外濾過膜を通過させる（プロテアーゼ除去）
10) 限外濾過した濾液をHEL測定ELISAキットにて測定
※BHTは大変水に溶けにくいのでエタノール中に溶かしてからPBSに添加します。PBSや水に添加したときに濁りを生じる場合が
あります。 |
| 8 |
検量線の計算方法 |
Q：検量線の近似関数は何が適していますか？
A：片対数（吸光度＝真数、濃度＝対数）の曲線近似であれば基本的にどのアルゴリズムでも問題なく使用できます。
特に最近のマイクロプレートリーダーには検量線計算機能を備えている機種も多くありますのでご活用ください。また、片対数の折れ線（ジグザグ）でも
十分な近似関数ができます。
お困りの場合には検量線計算依頼フォームより、弊社までデータをお送りください。
マイクロプレートリーダーにつきましては450nmの吸光度を測定できる機種であれば、基本的にどの機種でも対応可能です。PCに接続されているタイプですと
検量線計算機能が使えるので便利です。例えば下記の機種はPC付きで比較的安価にて入手可能です。
機種例：「吸光マイクロプレートリーダー サンライズリモート」 和光純薬工業（株）Code. 523-79691
⇒詳細はこちらをご覧ください。
ELISA検量線の計算ソフトウェアにつきましては、例えば下記のような製品が利用可能です。
「LS-PLATE manager2004」和光純薬工業（株）code.293-44751（Windows版）
「LS-PLATE manager2000」和光純薬工業（株）code.292-34951（Macintosh版）
⇒詳細はこちらをご覧ください。
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| 9 |
ELISAキットの
分割使用について |
Q：ELISAキットは何回に分けて使えますか？
A：弊社のELISAキットは8ウェル*12本で構成されておりますので、サンプル数に合わせて分割して
ご利用いただけます。測定ごとに毎回検量線を作成する必要がありますのでご注意ください。検量線には6レベル*3＝18ウェルが
必要です。殆どのサンプルは-20℃以下で安定に保存できますので、一度にまとめて測定した方がより多くのサンプルを
測定できます。
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| 10 |
副波長の設定について： |
副波長を設定する場合には600〜650nmを使用します。
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| 11 |
αキモトリプシンについて： |
加水分解処理に使用するαキモトリプシンはSigmaより入手可能です。
Code C-4129, α-chymotrypsin from bovine pancreas. type II, 250 mg, 40 units/mg protein
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| 12 |
限外濾過フィルターについて： |
従来推奨しておりました、Millipore社 Microcon YM-10は販売終了となっております。代替品としましては、
日本ポール（株）製 ナノセップ遠心ろ過デバイス オメガメンブレン（分画分子量10KDa、Code. OD010C34）等が
利用可能です。商品の情報は、
Siyaku.com（和光純薬工業）にて、品番（OD010C34）を
検索頂ければ見つかります。
フィルターの使用説明書に従い、必ず洗浄してからご利用ください。
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| 【参考文献】 |
| 1) |
Y. Kato, Y. Mori, Y. Makino, Y. Morimitsu, S. Hiroi, T. Ishikawa, T. Osawa.:
Formation of Nε-(hexanonyl) lysine in protein exposed to lipid hydroperoxide.
J. Biol. Chem. 274(29) p20406-20414 (1999) |
| 2) |
Y. Kato, T. Osawa:
Detection of lipid hydroperoxide-derived protein modification with polyclonal antibodies.
Methods in Molecular Biology, vol. 186, Oxidative stress biomarkers and antioxidant protocols,
D Armstrong, Ed., Human Press Inc., NJ, USA, p37-44 |
| 3) |
児玉 充央ら:
「ヒト粥状硬化巣における酸化変性産物Ｎε-(hexanonyl) lysineおよびdityrosineの局在に関する免疫組織化学的検討」
日本動脈硬化学会（2002） |
| 4) |
Y. Kato, Y. Miyake, K. Yamamoto, Y. Shimomura, H. Ochi, Y. Mori, T. Osawa:
Preparation of a monoclonal antibody to Nε-(hexanonyl) lysine: applycation to the evaluation of protective effects of
flavonoid supplementation against exercise-induced oxidative stress in rat skeletal muscle.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 274(2), p389-393 (2000) |
| 5) |
M. Naito, Wu X, H. Nomura, M. Kodama, Y. Kato, Y. Kato, T. Osawa:
The protective effects of tetrahydrocurcumin on oxidative stress in cholesterol-fed rabbits.
J Atheroscler Thromb. 9(5), p243-250 (2002) |
| 6) |
H. Arai, Y. Kato, K. Fukunaga, S. Mohri, and K. Nakamura:
Formation of Nepsilon-(hexanonyl)lysine in oxidized human very-low density lipoprotein.
J. Electrophoresis 48, p37-40 (2004) |
| 7) |
Y. Kato, A. Yoshida, M. Naito, Y. Kawai, K. Tsuji, M. Kitamura, N. Kitamoto, and T. Osawa:
Identification and Quantification of N-epsilon-(Hexanoyl)lysine in human urine by liquid chromatography/tandem mass spectrometry.
Free Radic. Bio.l Med. 37(11), p1864-1874 (2004) |
| 8) |
T. Osawa, Y. Kato:
Protective role of antioxidative food factors in oxidative stress caused by hyperglycemia.
Ann N Y Acad Sci. 1043, p440-451 (2005) |
| 9) |
K. Minato, M. Gono,H. Yamaguchi, Y. Kato, T. Osawa:
Accumulation of Nepsilon-(Hexanoyl)lysine, an oxidative stress biomarker, in rice seeds during storage.
Biosci Biotechnol Biochem. 69(9), p1806-1810 (2005)
コメ（ササニシキ）を40℃で保存するとHELが上昇することが報告されています。 |
| 10) |
Ryo K, Yamada H, Nakagawa Y, Tai Y, Obara K, Inoue H, Mishima K, Saito I:
Possible involvement of oxidative stress in salivary gland of patients with Sjogren's syndrome.
Pathobiology. 73(5),p252-260(2006)
唾液中のHELはシェーグレン症候群において高値を示すことが報告されています。 |
| 11) |
Suzuki T, Kazui T, Yamamoto S, Washiyama N, Ohkura K, Ohishi K, Bashar AH, Yamashita K,
Terada H, Suzuki K, Akuzawa S, Fujie M:
Effect of prophylactically administered edaravone during antegrade cerebral perfusion in a canine model of old cerebral
infarction.
J Thorac Cardiovasc Surg.133(3),p710-716(2007) |
| 12) |
Shimizu K, Ogawa F, Akiyama Y, Muroi E, Yoshizaki A, Iwata Y, Komura K, Bae S, Sato S:
Increased Serum Levels of N(epsilon)-(hexanoyl)lysine, A New Marker of Oxidative Stress, in Systemic Sclerosis.
J Rheumatol. 35(11),p2214-2219(2008)
全身性強皮症患者（limited cutaneous SSc及びdiffuse cutaneous SSc）の血清中のHEL濃度は、
健常者対照に比べ有意に高値を示します。また、血清中のHEL濃度は、抗ガラクトース欠損IgGおよびRF力価と正の相関を示すことが
報告されています。 |
| 13) |
Tamura H, Takasaki A, Miwa I, Taniguchi K, Maekawa R, Asada H, Taketani T, Matsuoka A, Yamagata Y,
Shimamura K, Morioka H, Ishikawa H, Reiter RJ, Sugino N:
Oxidative stress impairs oocyte quality and melatonin protects oocytes from free radical damage and improves fertilization rate.
J Pineal Res 44(3),p280-287(2008)
濾胞液を対象とした研究例です。 |
| 14) |
Sakamoto Y, Ishikawa T, Kondo Y, Yamaguchi K, Fujisawa M:
The assessment of oxidative stress in infertile patients with varicocele.
BJU Int. 101(12),p1547-1552(2008)
不妊症男性患者（無精子症および精子減少症）の精漿中のHEL濃度は健常対照に比べ高値を示すこと、
精索静脈瘤切除により精漿HEL濃度が低下することが報告されています。 |
| 15) |
Kageyama Y, Takahashi M, Nagafusa T, Torikai E, Nagano A:
Etanercept reduces the oxidative stress marker levels in patients with rheumatoid arthritis.
Rheumatol Int. 28(3),p245-251(2008)
関節リウマチ患者22名を対象に、TNF-α阻害剤Etanerceptを投与。尿中HEL濃度は治療開始後3ヶ月及び
6ヶ月において低下することが報告されています。 |
| 16) |
Rummenie VT, Matsumoto Y, Dogru M, Wang Y, Hu Y, Ward SK, Igarashi A, Wakamatsu T, Ibrahim O, Goto E,
Luyten G, Inoue H, Saito I, Shimazaki J, Tsubota K:
Tear cytokine and ocular surface alterations following brief passive cigarette smoke exposure.
Cytokine. 43(2),p200-208(2008)
涙液を対象としたHELの測定例です。チャンバー内における5分間の受動喫煙で、涙液中のHEL濃度が曝露前（297±66 nmol/L）
に比べ曝露後24時間（409±188 nmol/L）で有意に高値を示すことが報告されています。 |
| 17) |
Tomofuji T, Sanbe T, Ekuni D, Azuma T, Irie K, Maruyama T, Tamaki N, Yamamoto T:
Oxidative damage of rat liver induced by ligature-induced periodontitis and chronic ethanol consumption.
Arch Oral Biol. 53(12),p1113-1118 (2008)
ラット歯周炎モデルおよびエタノール投与は酸化ストレスを惹起することが報告されています。 |
| 18) |
Ekuni D, Tomofuji T, Sanbe T, Irie K, Azuma T, Maruyama T, Tamaki N, Murakami J, Kokeguchi S, Yamamoto T:
Periodontitis-induced lipid peroxidation in rat descending aorta is involved in the initiation of atherosclerosis.
J Periodontal Res. Feb 6 (2009)
歯周炎とアテローム性動脈硬化病変との関連性に関する研究です。ラット歯周病モデルにおいて血清および組織中の
HELが増加することが報告されています。 |
| 19) |
Sanbe T, Tomofuji T, Ekuni D, Azuma T, Irie K, Tamaki N, Yamamoto T, Morita M:
Vitamin C intake inhibits serum lipid peroxidation and osteoclast differentiation on alveolar bone in rats fed on
a high-cholesterol diet.
Arch Oral Biol. 54(3),p235-240(2009)
高コレステロール食を投与したラットにおいて血清HEL濃度が高値を示すこと、ビタミンC投与は
血清HELを低下させる効果のあることが報告されています。 |
| 20) |
Higuchi A, Takahashi K, Hirashima M, Kawakita T, Tsubota K:
Selenoprotein P Controls Oxidative Stress in Cornea.
PLoS ONE 5(3) e9911 (2010)
ドライアイ（涙腺を外科的に除去したSDラット）において、角膜中のHELは有意に増加することが
報告されています（正常眼 約3.7 pmol/mg protein ⇒処置眼 約5.4 pmol/mg protein）。
セレノプロテインPが角膜における酸化ストレス防御において重要な役割を果たすことが示唆されています。 |
| 21) |
Proliferative diabetic retinopathy and relations among antioxidant
activity, oxidative stress, and VEGF in the vitreous body.
Hiroshi Izuta, Nozomu Matsunaga, Masamitsu Shimazawa, Tetsuya Sugiyama, Tsunehiko Ikeda, Hideaki Hara
Molecular Vision 16, p130-136 (2010)
糖尿病患者（増殖性網膜症：proliferative diabetic retinopathyと黄斑円孔：macular hole）について
血清および硝子体のHELを測定しています。増殖性網膜症患者の血清HEL (4.9±1.6 nmol/L)は
黄斑円孔患者 (3.5±1.4 nmol/L)に比べ有意に高値を示します。硝子体のHELは増殖性網膜症 (4.9±0.8 nmol/L)において
黄斑円孔 (4.3 nmol/L)に比べ有意に高値を示します。 |
| 22) |
Determination of HEL (Hexanoyl-Lysine Adduct): A Novel Biomarker for Omega-6 PUFA Oxidation.
K Sakai, S Kino, A Masuda, M Takeuchi, T Ochi, J Osredkar, B Rejc, K Gersak, N Ramarathnam, Y Kato:
Y Kato Ed., Subcellular Biochemistry 77, p61-72(2014)
本ELISAキットの確立、性能評価試験の論文です |
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| 抗HELモノクローナル抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
適用可能な動物種 |
ヒト、ウサギ、ラットなど幅広い動物種に適用可能です。
マウス組織への適用の際には、組織サンプル由来のマウスIgGへの対策が必要です。
例えばVector社Vector M.O.M. Immunodetection kit (フナコシより入手可能)が利用可能と思われます。
抗HEL抗体による免疫組織染色データをひろく集め、皆様のご研究に役立てたいと考えております。
⇒ぜひ実験例をbiotech@jaica.comまでご一報ください。
どうぞよろしくお願い申し上げます。 |
| 2 |
免疫組織染色プロトコル |
⇒詳細はこちらをご参照ください。
【培養細胞への適用例】:
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVECs）におけるHEL染色例。
Maeda R, et.al.:Hypertens Res 31(1)p141-151(2008)
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| 3 |
Western Blottingへの適用 |
本抗体はウェスタンブロットへの適用可能です。HELは主にタンパク質への付加体として存在しておりますので、
複数のバンドが検出されると考えられます。
【参考文献】H. Arai, Y. Kato, K. Fukunaga, S. Mohri, and K. Nakamura:
Formation of Nepsilon-(hexanonyl)lysine in oxidized human very-low density lipoprotein.
J. Electrophoresis 48, p37-40 (2004)
酸化処理したヒトVLDLでのHEL検出例です。 |
| 4 |
ラット腎における染色条件例 |
組織：シスプラチン誘発腎障害 (ラット)
一次抗体希釈倍率：75倍
抗原賦活：実施せず
二次抗体：ニチレイ ヒストファインシンプルステインラット (M)
※出典 Sugiyama A, et. al.; J Vet Med Sci. 73(6), p821-826 (2011)
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|
| 【参考文献】 |
| 1) |
Y. Kato, Y. Mori, Y. Makino, Y. Morimitsu, S. Hiroi, T. Ishikawa, T. Osawa.:
Formation of Nε-(hexanonyl) lysine in protein exposed to lipid hydroperoxide.
J. Biol. Chem. 274(29) p20406-20414 (1999) |
| 2) |
児玉 充央ら:
「ヒト粥状硬化巣における酸化変性産物Ｎε-(hexanonyl) lysineおよびdityrosineの局在に関する免疫組織化学的検討」
日本動脈硬化学会（2002） |
| 3) |
Y. Kato, Y. Miyake, K. Yamamoto, Y. Shimomura, H. Ochi, Y. Mori, T. Osawa:
Preparation of a monoclonal antibody to Nε-(hexanonyl) lysine: applycation to the evaluation of protective effects of
flavonoid supplementation against exercise-induced oxidative stress in rat skeletal muscle.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 274(2), p389-393 (2000) |
| 4) |
H. Arai, Y. Kato, K. Fukunaga, S. Mohri, and K. Nakamura:
Formation of Nepsilon-(hexanonyl)lysine in oxidized human very-low density lipoprotein.
J. Electrophoresis 48, p37-40 (2004) |
| 5) |
Tomaru M, Takano H, Inoue K, Yanagisawa R, Osakabe N, Yasuda A, Shimada A, Kato Y, Uematsu H:
Pulmonary exposure to diesel exhaust particles enhances fatty change of the liver in obese diabetic mice.
Int J Mol Med. 19(1):17-22 (2007) |
| 6) |
Fukuchi Y, Miura Y, Nabeno Y, Kato Y, Osawa T, Naito M:
Immunohistochemical detection of oxidative stress biomarkers, dityrosine and N(epsilon)-(hexanoyl)lysine,
and C-reactive protein in rabbit atherosclerotic lesions.
J Atheroscler Thromb 15(4)p185-192(2008)
ウサギ動脈硬化病巣においてHELが免疫学的に検出されています。 |
| 7) |
Maeda R, Noiri E, Isobe H, Homma T, Tanaka T, Negishi K, Doi K, Fujita T, Nakamura E:
A water-soluble fullerene vesicle alleviates angiotensin II-induced oxidative stress in human umbilical venous endothelial cells.
Hypertens Res 31(1)p141-151(2008)
ヒト培養細胞（HUVECs）を対象に、抗HEL抗体による染色が行われています。 |
| 8) |
Sango K, Yanagisawa H, Kato K, Kato N, Hirooka H, Watabe K:
Differential Effects of High Glucose and Methylglyoxal on Viability and Polyol Metabolism in Immortalized Adult Mouse Schwann Cells.
Open Diabetes J. 1, p1-11(2008)
マウス由来 培養神経細胞を対象に、メチルグリオキザール（methylglyoxal: MG）及び糖負荷を行い、アクロレイン、
4-HNE、HELを免疫染色により検出しています。 |
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