こちらでは酸化ストレスマーカーの技術情報、学術情報をご紹介しております。皆様のご研究に役立てて頂ければ
幸いです。
またよろしければ、学会や論文等で発表された内容をご紹介頂ければ大変ありがたく思います。
ご質問・コメントなどお気軽にお送り頂けると助かります。
biotech@jaica.comまでお気軽にお知らせください。
対象となるマーカーも徐々に増やしていきたいと思います。どうぞよろしくお願い申し上げます。
弊社は本ホームページおよび製品、添付文書等を作成するにあたり細心の注意を払っておりますが、これらによる損害が万一発生した場合でも、
弊社は責を負いませんので予めご了承ください。また、製品の価格、仕様、試薬構成、測定手順等は、製造元の都合により予告無く変更される
場合があります。 |
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| 抗8-OHdGモノクローナル抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
適用可能な動物種 |
ヒト、ウサギ、ラットなど幅広い動物種に適用可能です。
マウス組織への適用の際には、組織サンプル由来のマウスIgGへの対策が必要です。
具体例としましてVector社Vector M.O.M. Immunodetection kit (フナコシより入手可能)が利用できます。マウス心臓血管などで
低バックグラウンドの良好な染色像が得られたとの情報をいただいております。内在性ペルオキシダーゼによる
バックグラウンドが問題となるケースでは、アルカリホスファターゼによる発色系をお奨めします。 |
| 2 |
免疫組織染色プロトコル |
⇒詳細はこちらをご参照ください。
また、8-OHdGの免疫組織染色につきましては、「酸化ストレスマーカー」学会出版センター(2005年)
p256-260「発癌における核酸修飾」豊國伸哉著 に詳しい解説があります。 |
| 3 |
免疫組織染色の条件設定 |
Q：8-OHdGの免疫組織染色で気をつけるポイントは何かありますか？
A：対象となる組織サンプルの種類や状態によって、染色条件を調整の調整が必要な場合があります。
正常な細胞でも10-6/dGオーダーの8-OHdGが存在しており、多くの研究例では酸化ストレスの亢進によって
これが数割〜数倍増加します。サンプル組織と比較対照との差異が大きくない場合には、1次抗体濃度など染色条件を
最適化する必要があります。
また、過酸化水素やUVなどヒドロキシラジカルを発生する条件下では、
正常dGが酸化されて8-OHdGが新たに生成される場合があります。過酸化水素による内因性ペルオキシダーゼ不活化処理は
お避けください。アルカリホスファターゼ系による染色をおすすめします。 染色される部位は主に細胞核です。 |
| 4 |
免疫組織染色の受託機関 |
Q：組織サンプルがあるのですが、免疫組織染色を実施してもらえませんか？
A：酸化マーカーの染色実績のある受託企業をご紹介いたします。
（株）バイオ病理研究所（TEL: 0978-72-0454）
http://www.biopathology.jp/
主に実験動物を対象とした組織標本作製、染色です。8-OHdG、4-HNEなど多数の実績があります。
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| 5 |
培養細胞の染色 |
Q：培養細胞を染色する際に、抗原賦活化処理によって細胞が剥がれてしまうのですが？
A：細胞の種類等、実験条件によっては細胞が剥がれやすいケースがあるようです。 このような場合には固定法として
ホルマリン固定ではなくブアン固定（Bouin fixation）をお奨めいたします。ブアン固定の場合には、抗原賦活化処理が
必要ありませんので、サンプル剥離の可能性が低くなると期待されます。 |
| 6 |
内因性ビオチンのブロッキング |
腎臓、肝臓、前立腺、腸においては内因性ビオチンのブロッキングが必要となる場合があります。
このような場合には、1次抗体反応の前にブロッキングを実施してください。
1) 0.001% avidin / PBSにて10〜15分インキュベート
2) PBSにて洗浄
3) 0.001% biotin / PBSにて10〜15分インキュベート
4) PBSにて洗浄 |
| 7 |
凍結切片への適用 |
凍結切片でも染色できる可能性はあると考えられますが、具体的な染色例の情報はありません。 |
| 8 |
蛍光標識での検出例
（マウス網膜組織・テキサスレッド） |
1) 内因性ビオチンのブロッキング(Vector社)
2) 内因性マウスIgGブロッキング(Vector社 MOM kit)
3) 抗8-OHdG抗体（5μg/mL,室温30分）
4) ビオチン標識-抗マウスIgG (室温10分)
5) テキサスレッド-アビジン (10μg/mL)
参考文献：Fujihara et.al., PLoS ONE 3(9),e3119 (2008) |
| 9 |
蛍光標識での検出例
（ヒト培養細胞・Fluor488） |
1) 4％ paraformaldehyde固定
2) RNase 100μg/mL, 10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 0.4M NaClにて37℃1時間
3) Proteinase K 10μg/mLにて室温7分
4) 4N HClにて室温7分
5) 0.2% Triton X/ PBSにてリンス
6) 抗8-OHdG抗体(1:50)
7) Fluor488標識-抗マウスIgG ヤギ抗体(1:200)
参考文献：Lee YA, at. al.,Biol Pharm Bull 31(6)p1265-1269(2008)
この文献では酸化ストレス負荷は300μM H2O2にて2時間処理しています。 |
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| 【参考文献】 |
| 1) |
T.Tanaka, Y.Nishiyama, K.Okada, K.Hirota, M.Matsui, J.Yodoi, H.Hiai, and S.Toyokuni:
Induction and nuclear translocation of thioredoxin by oxidative damage in the mouse kidney: independence of tubular necrosis and
sulfhydryl depletion.
Lab. Invest. 77(2), p145-155 (1997) |
| 2) |
Y.Hattori, C.Nishigori, T.Tanaka, K.Uchida, O.Nikaido, T.Osawa, H.Hiai, S.Imamura, and S.Toyokuni:
8-Hydroxy-2'deoxyguanosine is increased in epidermal cells of hairless mice after chronic ultraviolet B exposure.
J. Invest. Dermatol. 107, p733-737 (1996) |
| 3) |
S.Toyokuni, T.Tanaka, Y.Hattori, Y,Nishiyama, A.Yoshida, K.Uchida, H.Hiai, H.Ochi, and T.Osawa:
Quantitative immunohistochemical determination of 8-hydroxy-2'deoxyguanosine by a monoclonal antibody N45.1: Its application
to ferric nitrilotriacetate-induced renal carcinogenesis model.
Lab. Invest. 76(3), p365-374 (1997) |
| 4) |
S.Takahashi, M.Hirose, S.Tamano, M.Ozaki, S.Orita, M.Takeuchi, H.Ochi, S.Fukuda, H.Kasai,
and T.Shirai:
Immunohistochemical detection of 8-hydroxy-2・deoxyguanosine in paraffin-embedded sections of
rat liver after carbon tetrachloride treatment.
Toxicol. Pathol. 26, p247-252 (1998) |
| 5) |
N.U.Ahmed, M.Ueda, O.Nikaido, T.Osawa and M.Ichihashi:
High levels of 8-hydroxy-2'deoxyguanosine appear in normal human epidermis after a singer dose of ultraviolet radiation.
Br. J. Dermatol. 140, p226-231 (1999) |
| 6) |
Y.Ihara, S.Toyokuni, K.Uchida, H.Odaka, T.Tanaka, H.Ikeda, H.Hiai, Y.Seino, and Y.Yamada:
Hyperglycemia causes oxidative stress in pancreatic -cells of GK rats, a model of type 2 diabetes.
Diabetes 48, p927-932 (1999) |
| 7) |
S.Kondo, S.Toyokuni, Y.Iwasa, T.Tanaka, H.Onodera, H.Hiai and M.Imamura:
Persistent oxidative stress in human colorectal carcinoma, but not in adenoma.
Free Rad. Biol. Med. 27, p401-410 (1999) |
| 8) |
S.Toyokuni, Y.Iwasa, S.Kondo, T.Tanaka, H.Ochi, and H.Hiai:
Intranuclear distribution of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine: An immunocytochemical study.
J. Histochem. Cytochem. 47(6), p833-835 (1999) |
| 9) |
S.Toyokuni:
Reactive oxygen species-induced molecular damage and its application in pathology.
Pathol. Internat. 49, p91-102 (1999) |
| 10) |
S.Toyokuni:
An in vitro Feton reaction model and the application of immunohistochemistry to detect oxidative damage.
Models and Methods in Cell Signaling and Gene Expression: Applications to Oxidative Stress Research., Chapter four pp40-54 (2000) |
| 11) |
K.Yamagami, Y.Yamamoto, M.Kume, Y.Ishikawa, Y.Yamaoka, H.Hiai and S.Toyokuni:
Formation of 8-hydroxy-2'deoxyguanosine and 4-hydroxy-2-nonenal-modified proteins in rat liver after ischemia-reperfusion:
Distinct localization of the two oxidatively modified products. Antioxidants & Redox Signaling, 2(1), p127-136 (2000) |
| 12) |
D.Nakae, H.Akai, H.Kishida, O.Kusuoka, M.Tsutsumi, and Y.Konishi:
Age and organ dependent spontaneous generation of nuclear 8-hydroxydeoxyguanosine in male Fischer 344 rats.
Lab. Invest. 80(2), p249-261 (2000) |
| 13) |
S.Liardet, C.Scaletta, R.Panizzon, P.Hohlfeld and L.L.Applegate:
Protection against pyrimidine dimmers, p53, and 8-hydroxy-2'deoxyguanosine expression in ultraviolet-irradiated
human skin by sunscreens: difference between UVB + UVA and UVB alone sunscreens.
J. Investigative Dermatol. 117(6), p1437-1441 (2001) |
| 14) |
Zhang N, Komine-Kobayashi M, Tanaka R, Liu M, Mizuno Y, Urabe T:
Edaravone reduces early accumulation of oxidative products and sequential inflammatory responses after transient
focal ischemia in mice brain.
Stroke. 36(10):p2220-2225(2005)
マウスに対し60分間虚血⇒再灌流処置。再灌流開始24ｈ/72ｈ/7日後の8-OHdGを免疫組織染色にて測定。
エダラボン投与penumbra部における8-OHdGは減少。 |
| 15) |
S Akatsuka, TT Aung, KK Dutta, L Jiang, HW Lee, YT Liu, J Onuki, T Shirase, K Yamasaki,
H Ochi, Y Naito, T Yoshikawa, H Kasai, Y Tominaga, K Sakumi, Y Nakabeppu, Y Kawai, K Uchida, A Yamasaki, T Tsuruyama,
Y Yamada and S Toyokuni:
Contracting genome-wide distribution of 8-hydroxyguanine and acrolein-modified adenine during oxidative stress
induced renal carcinogenesis.
Am. J. Pathol. 169(4), p1328-1342 (2006) |
| 16) |
Subrata K. Biswas, Jose B. Lopes De Faria:
Which comes first: Renal inflammation or oxidative stress in spontaneously hypertensive rats?
Free Radical Research, 41(2), p216 -224(2007)
SHR高血圧ラットを対象に腎臓中の8-OHdGを免疫組織染色にて検出。3週齢で8-OHdG陽性細胞が増加。 |
| 17) |
JUN YAMAKOSHI, FUJIO OTSUKA, ATSUSHI SANO, SHOICHI TOKUTAKE, MAKOTO SAITO, MAMORU KIKUCHI and
YOSHIRO KUBOTA:
Lightening Effect on Ultraviolet-Induced Pigmentation of Guinea Pig Skin by Oral Administration of a Proanthocyanidin-Rich
Extract from Grape Seeds.
Pigemt Cell Res 16, p629-638(2003)
モルモット皮膚における染色例です。UV照射により8-OHdG陽性細胞が増加しますがグレープシードエキス投与により
8-OHdG陽性細胞の増加が抑制されることが報告されています。 |
| 18) |
T. Ichiseki, A. Kaneuji, S. Katsuda1, Y. Ueda,T. Sugimori and T. Matsumoto:
DNA oxidation injury in bone early after steroid administration is involved in the pathogenesis of steroid-induced osteonecrosis.
Rheumatology 44,p456-460(2005)
ウサギにおける染色例です。DAKO社 EnVision(TM)が利用されています。 |
| 19) |
Nakajima Y, Inokuchi Y, Shimazawa M, Otsubo K, Ishibashi T, Hara H:
Astaxanthin, a dietary carotenoid, protects retinal cells against oxidative stress in-vitro and in mice in-vivo.
J Pharm Pharmacol. 60(10), p1365-1374(2008)
抗酸化物質アスタキサンチンのマウスにおける研究例です。 |
| 20) |
Fujihara M, Nagai N, Sussan TE, Biswal S, Handa JT:
Chronic cigarette smoke causes oxidative damage and apoptosis to retinal pigmented epithelial cells in mice.
PLoS ONE. 3(9) e3119(2008)
マウス網膜色素上皮細胞の染色例です。テキサスレッドを使った蛍光標識で検出されています。 |
| 21) |
Lee YA, Cho EJ, Yokozawa T:
Protective effect of persimmon (Diospyros kaki) peel proanthocyanidin against oxidative damage under H2O2-induced cellular senescence.
Biol Pharm Bull 31(6)p1265-1269(2008)
ヒト繊維芽細胞を使った研究例です。300μM 過酸化水素にて2時間刺激した細胞を対象に、プロアントシアニジンによる
保護作用を検証しています。検出にはFluor488を使った蛍光標識が用いられています。 |
| 22) |
Shinya Toyokuni, Ayaka Hirao, Tamae Wada, Ryoji Nagai, Akira Date, Takashi Yoshii, Shinya Akatsuka,
Yoriko Yamashita and Akira Kawada:
Age- and sun exposure-dependent differences in 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine and Nε-(carboxymethyl)lysine
in human epidermis.
J Clin Biochem Nutr: doi 10.3164/jcbn.11-05 (2011)
ヒト皮膚を対象とした免疫組織染色例です。紫外線（日光）照射された部位において8-OHdGの染色強度が強くなること、
日光による8-OHdG形成/防御/修復のメカニズムが年齢により異なる可能性があることが示唆されています。 |
| 23) |
Dhillon H, Chikara S, Reindl KM:
Piperlongumine induces pancreatic cancer cell death by enhancing reactive oxygen species and DNA damage.
Toxicol Rep.1:309-318(2014)
抗8-OHdG抗体による免疫組織染色例。標識抗体にはCF633標識-抗マウス ヤギ抗体(1:250)を使用 |
| 24) |
Sawada O, Perusek L, Kohno H, Howell SJ, Maeda A, Matsuyama S, Maeda T:
All-trans-retinal induces Bax activation via DNA damage to mediate retinal cell apoptosis.
Exp Eye Res. 123,p27-36(2014). doi: 10.1016/j.exer.2014.04.003.
ヒト網膜色素上皮細胞での8-OHdG染色例。標識2次抗体には、Cy-3標識-抗マウス抗体を使用 |
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